单克隆抗体的制备及应用

单克隆抗体的制备及应用

        单克隆抗体（monoclonal antibody，McAb）是由单一B 细胞克隆产生、仅识别特定抗原表位的高度均一抗体，1975 年由 Kohler 和 Milstein 创立杂交瘤技术制备而成。单克隆抗体特异性强、纯度高，广泛用于 ELISA、Western blot、免疫沉淀、亲和层析、流式细胞术等科研实验，也是临床诊断与靶向治疗的重要工具，在生命科学与医学领域应用价值突出。本期内容带你读懂什么是单克隆抗体？及其制备原理、制备流程与应用。

一、单克隆抗体的基本概述

        单克隆抗体定义由单一B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体，称为单克隆抗体。

图1. 抗体结构

        通常采用杂交瘤技术来制备，杂交瘤（hybridoma）抗体技术是在细胞融合技术的基础上，将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有增殖能力的骨髓瘤细胞融合为B细胞杂交瘤。用具备这种特性的单个杂交瘤细胞培养成细胞群，可制备针对一种抗原表位的特异性抗体即单克隆抗体。

        单克隆抗体类型单克隆抗体有两种类型:①一种是识别初级蛋白结构的线性表位的抗体;②一种是识别二级、三级和更高结构的抗体。在生命科学研究中，使用识别线性表位的抗体包括ELISA和Westernblot方法。然而，使用这类抗体的应用有限而结构识别抗体有广泛的应用，如免疫沉淀，免疫染色等。

二、单克隆抗体技术的基本原理

        要生产大量的单一抗体，必须满足两个条件：

        ①能分泌特异性抗体——B淋巴细胞具备这一能力，但它在体外不能无限增殖。②能在体外大量繁殖——骨髓瘤细胞（一种癌细胞）可以无限增殖，但它不分泌特定抗体。

图2. 杂交瘤细胞同时具备亲本细胞的两大优势

        科学家的奇思妙想是：把这两种细胞融合在一起，让一个细胞同时具备两种"超能力"。 这就是杂交瘤细胞（hybridoma）——它继承了B细胞的抗体合成能力，又获得了骨髓瘤细胞的无限增殖能力。

三、单克隆抗体制备的基本流程

        单克隆抗体的制备过程拆解为5个关键步骤。

图3. 单克隆抗体的制备流程

（1）免疫动物 

        免疫动物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠产生致敏B淋巴细胞的过程。一般选用6-8周龄雌性Balb/c小鼠，按照预先制定的免疫方案进行免疫注射。抗原通过血液循环或淋巴循环进入外周免疫器官，刺激相应B淋巴细胞克隆，使其活化、增殖，并分化成为致敏B淋巴细胞。

（2）细胞融合

  采用眼球摘除放血法处死小鼠，无菌操作取出脾脏，在平皿内挤压研磨，制备脾细胞悬液。 将准备好的同系骨髓瘤细胞与小鼠脾细胞按一定比例混合，并加入促融合剂聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，淋巴细胞可与骨髓瘤细胞发生融合，形成杂交瘤细胞。

（3）选择性培养

选择性培养的目的是筛选融合的杂交瘤细胞，一般采用HAT选择性培养基。在HAT培养基中，未融合的骨髓瘤细胞因缺乏次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，不能利用补救途径合成DNA而死亡。它的工作原理依赖于： 细胞合成 DNA 有两条途径。

HAT培养基的精妙设计H = Hypoxanthine 次黄嘌呤A= Aminopterin 氨基蝶呤（叶酸的拮抗剂）T= Thymidine 胸腺嘧啶核苷未融合的淋巴细胞虽具有次黄嘌呤-鸟嘌呤-磷酸核糖转移酶，但其本身不能在体外长期存活也逐渐死亡。只有融合的杂交瘤细胞由于从脾细胞获得了次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶，并具有骨髓瘤细胞能增殖的特性，因此能在HAT培养基中存活和增殖。

（4）杂交瘤阳性克隆的筛选与克隆化

在HAT培养基中生长的杂交瘤细胞，只有少数是分泌预定单克隆抗体的细胞，因此，必须进行筛选和克隆化。通常采用有限稀释法进行杂交瘤细胞的克隆化培养。采用免疫学方法，筛选出能产生所需单克隆抗体的阳性杂交瘤细胞，并进行克隆扩增。经过鉴定其所分泌单克隆抗体的免疫球蛋白类型、亚类、特异性、亲和力、识别抗原的表位及其分子量后，及时进行冻存。

（5）单克隆抗体的制备

单克隆抗体的大量制备主要采用动物体内诱生法和体外培养法：①体内诱生法 取Balb/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液体石腊或降植烷进行预处理。1-2周后，腹腔内接种杂交瘤细胞。杂交瘤细胞在小鼠腹腔内增殖，并产生和分泌单克隆抗体。约1-2周，可见小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可获得单克隆抗体。②体外培养法  将杂交瘤细胞置于培养瓶中进行培养。在培养过程中，杂交瘤细胞产生并分泌单克隆抗体，收集培养上清液，离心去除细胞及其碎片，即可获得所需要的单克隆抗体。但这种方法产生的抗体量有限。近年来，新型培养技术和装置不断出现，提高了抗体的生产量。杂交瘤细胞融合后，要进行筛选后才能使用。杂交瘤细胞分为两次：一次是筛选出杂交瘤细胞；另一次是在初选的杂交瘤细胞中筛选出能产生特异性抗体的杂交瘤细胞，这两次筛选的方法和原理各不相同。

四、单克隆抗体制备的应用

        单克隆抗体的制备可应用于以下生命科学实验并具有医用价值：

        （1）凝集实验：haemaglutination

        （2）沉淀反应：Precipitation  reaction

        （3）ELISA 等免疫学检测

        （4）亲和层析：分离蛋白质

        （5）免疫印记（western  blotting)

        （6）免疫沉淀

        （7）BIAcore  biosensor:检测Ab-Ag或与蛋白的亲和力

        （8）放射免疫学方法检测免疫复合物

        （9）磁珠分离细胞

        （10）流式细胞仪：用于细胞的分型和细胞分离

        （11）临床疾病的诊断和治疗