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更新时间：2026-05-25 
浏览次数：68非洲猪瘟（英文名称：Infection with African swine fever virus，简称：ASF）是由非洲猪瘟病毒（英文名称：African Swine fever virus，简称：ASFV）感染家猪和各种野猪（如非洲野猪、欧洲野猪等）而引起的一种急性、出血性、烈性传染病。世界动物卫生组织（OIE）将其列为法定报告动物疫病，该病也是我国重点防范的一类动物疫情。
非洲猪瘟临床症状与猪瘟症状相似，只能依靠实验室监测确诊。
加入免疫抗体100µL /孔， 轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
再加入酶标物100µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应20min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果见下图：
结论：共选62个阳性孔的细胞进行抗体特异性测定。
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果见下图：
共选出14株效价高、抗体特异性好的细胞进行第一次亚克隆。
株号有：2C4 3B9 3D6 3F10 4D1 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 7D7 7C8 8G10 4F10
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果见下图：
结论：共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。
株号有：2C4 3D6 3F10 4F4 5D2 5D4 5D7 7D4 8G10 4F10
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果见下图：
结论：经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（5D2 5D4 5D7 3F10）扩大并冻存； 有六株细胞细胞进行第三次亚克隆。
三次亚克隆株号有：2C4 3D6 4F4 7D4 8G10 4F10
加入酶标物50µL /孔， 再加入细胞上清50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果见下图：
结论：共选出10株效价高的细胞进行第二次亚克隆。经显微镜观察，有四株细胞100%纯阳性（8G10 2C4 4F4 7D4 ）扩大并冻存；4F10和3D6株细胞转阴性，扔之。
将筛选到的非洲猪瘟8株单抗，制备腹水并测腹水效价。
加入酶标物50µL /孔， 再加入稀释后的抗体50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应30min。
小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加入洗涤工作液250µL/孔，每次静置20s，甩去孔内液体，重复洗涤3次，最后一次用吸水纸拍干。
加入底物液A液50µL/孔，再加底物显色液B液50µL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置37℃避光环境中反应10min。
结果及结论见下表：
ASFV共8株Ab，各按生产条件标记1条金垫后测试结果。
标记：1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4 4号.5D2 5号.5D4 6号.7D4 7号.8G10 8号.混合 9号.兔多抗。
划线：用9株Ab同时划9种T线，1/1稀释，稀释液是动物CB液。
1-8号单抗；T线：兔多抗划线1:1（动物包被液稀释）。
最初先用 1-8号金条和兔多抗1：1 划线测试阳性病料（1:5，用2*样稀稀释，非处理样品垫），如下图，8-10分观察，结论：爬速过快，需要调整爬速。
接着用 1-8号金条和兔多抗1：1 划线测试阳性病料（1:5，用1*样稀稀释，非处理样品垫），8-10分观察，如下图：
结论如下表：
1-8号金条与兔多抗1：1 测试阳性结果。
继续优化实验方案，用 1-8号金条和兔多抗1：1 分别测试阳性病料（1:5，用1*样稀稀释，用滤血膜）和猪阴性血清（1:5，用1*样稀稀释），8-10分观察，分别如下图：
多次实验结论：1,2,3,4,5,8,号抗体与兔多抗（1：1）反应，6,7号抗体与兔多抗（1：1）无反应。并重复复核实验1,2,3,4,5,8,这六种抗体与兔多抗的反应，如下图，证明结论正确。
9号兔多抗标记；T线：1，2，3,4,5,8号单抗1：1（动物包被液稀释）。
阳性见下图
阴性见下图
结论1,2号抗体最好。
9号兔多抗标记金条与1，2，3,4,5,8号抗体划线测试阴阳性结果
1号.2C4 2号.3F10 3号.4F4
4号.5D2 5号.5D4 8号.混合
1号抗体标记金条，依次为2 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
2号抗体标记金条，依次为1 3 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
3号抗体标记金条，依次为1 2 4 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
4号抗体标记金条，依次为1 2 3 5 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
5号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 8号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
8号抗体标记金条，依次为1 2 3 4 5号抗体1：1划线，测试阳性（病料1:5稀释，用1*样稀），见下图：
测试阴性（猪血清1:5，用1*样稀），结果见下图：
实
验
结
论
经重复观察实验，以下四组单抗交叉配对效果较好。
2号抗体（3F10）标记配对3号抗体（4F4 ）划线
2号抗体（3F10）标记配对8号抗体（8株混合后）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对4号抗体（5D2）划线
3号抗体（4F4 ）标记配对8号抗体（8株混合后）划线
经进一步调试，2,5,6,7,20经PCR测定阳性的，试纸条测试液为阳性，其他为阴性，符合率100%。
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